為指導(dǎo)各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)、疾控機(jī)構(gòu)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)機(jī)構(gòu)開展基孔肯雅熱實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作，規(guī)范檢測(cè)程序，提高檢測(cè)質(zhì)量，制定本方案。

一、檢測(cè)對(duì)象

基孔肯雅熱病例、重點(diǎn)地區(qū)抽樣調(diào)查人群，媒介伊蚊成蚊和幼蟲。

二、樣本采集、保存和運(yùn)輸

(一)樣本采集。

1.血清樣本。

①病例急性期血清。用無菌真空干燥管，采集患者非抗凝血5mL，及時(shí)分離血清，分裝2份保存于做好標(biāo)記的、帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈的凍存管內(nèi)。 

②病例恢復(fù)期血清。必要時(shí)，用無菌真空干燥管，采集發(fā)病7日后恢復(fù)期患者靜脈血 5ml(非抗凝血)，及時(shí)分離血清，分裝2 份保存于做好標(biāo)記的、帶螺旋蓋、內(nèi)有墊圈的凍存管內(nèi)。采集時(shí)間與急性期血清間隔時(shí)間不少于3天。 

2.蚊媒樣本。

采集媒介伊蚊活動(dòng)高峰期和基孔肯雅熱流行季節(jié)的伊蚊成蚊及幼蟲，分類鑒定后，填寫媒介伊蚊樣本采集信息表，按照采集地點(diǎn)分裝，每管10-20只，低溫保存。

(二)樣本保存。

24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)的樣本可置于 4℃環(huán)境中保存，1周內(nèi)檢測(cè)的樣本應(yīng)置于-20℃環(huán)境中保存，需長(zhǎng)期使用的樣本應(yīng)置于-70℃或以下環(huán)境中保存。

(三)樣本運(yùn)輸。

基孔肯雅病毒的危害程度屬第二類病原微生物，血清和伊蚊標(biāo)本應(yīng)采用A類包裝(編號(hào):UN2814)。樣本運(yùn)輸時(shí)應(yīng)遵守國(guó)家相關(guān)生物安全規(guī)定，采用低溫運(yùn)輸，避免反復(fù)凍融。用于開展病原學(xué)監(jiān)測(cè)的樣本，應(yīng)于48小時(shí)內(nèi)運(yùn)送至地市級(jí)或省級(jí)疾控中心。

三、病例實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

(一)病原學(xué)檢測(cè)。

1.核酸檢測(cè)。一般發(fā)病后7天內(nèi)血液樣本病毒核酸檢出率較高，常采用實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 基于核酸擴(kuò)增的方法進(jìn)行檢測(cè)，可用于早期診斷。

2.病毒培養(yǎng)分離。一般發(fā)病后5天內(nèi)血液樣本病毒培養(yǎng)分離率較高，通常將樣本接種至哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Vero、BHK21)中進(jìn)行分離與培養(yǎng)，待其出現(xiàn)病變特征后，采用抗原或核酸檢測(cè)手段鑒定病毒種類。

3.抗原檢測(cè)。常用雙抗體夾心ELISA法或免疫層析法進(jìn)行抗原檢測(cè)，一般適用于發(fā)病后5天以內(nèi)血液樣本，檢出陽性可用于早期診斷。

4.基因組序列分析。采用一代 Sanger 法或擴(kuò)增子技術(shù)進(jìn)行病毒E2和E1蛋白編碼基因序列或全基因組測(cè)序，測(cè)序技術(shù)經(jīng)質(zhì)控合格后，方可用于后續(xù)生物信息分析。二代測(cè)序平臺(tái)覆蓋深度應(yīng)不低于 10x，三代測(cè)序平臺(tái)覆蓋深度應(yīng)不低于50x，全基因組測(cè)序覆蓋度應(yīng)不低于 98%。

(二)血清學(xué)檢測(cè)。

1.特異性 IgM 抗體。采用 ELISA、免疫層析等方法檢測(cè)，是輔助診斷基孔肯雅熱急性期或近期感染的重要指標(biāo)。

2.特異性 IgG 抗體。采用 ELISA、免疫熒光(IFA)、免疫層析等方法檢測(cè)。患者恢復(fù)期血清 IgG 抗體陽轉(zhuǎn)或滴度較急性期呈4 倍及以上升高可以確診。

3.中和抗體。采用空斑減少中和實(shí)驗(yàn)、微量中和實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)，可用于分型。患者恢復(fù)期血清中和抗體陽轉(zhuǎn)或滴度較急性期呈4 倍及以上升高可以確診。

四、蚊媒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

將分類分裝后的媒介伊蚊成蚊或幼蟲進(jìn)行研磨，開展核酸檢測(cè)，病毒核酸陽性的樣本可由有能力或資質(zhì)的地市級(jí)或省級(jí)疾控中心進(jìn)行病毒培養(yǎng)分離和基因組序列分析。蚊媒核酸檢測(cè)、病毒分離培養(yǎng)和基因組序列分析的檢測(cè)方法同病例檢測(cè)。

五、結(jié)果報(bào)送和反饋

各縣(市、區(qū))實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果應(yīng)在24小時(shí)內(nèi)反饋樣本送檢單位。本地疫情發(fā)生后，省級(jí)疾控中心應(yīng)于逐月將基孔肯雅熱實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)與病原學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果報(bào)送至中國(guó)疾控中心。

六、生物安全

基孔肯雅熱實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)應(yīng)按照《人間傳染的病原微生物目錄》規(guī)定要求開展實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，做好生物安全防護(hù)。